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2.解析データに関する質問
  1. 解析データファイル名の「58.21_G03_013」はどういう意味ですか。

  2. 塩基配列のデータは正常に開くことができましたが、メールに添付された残りのファイルは開くことができません。このファイルを開くには、特別なプログラムが必要でしょうか。

  3. 未反応のDyeと見られるピークをなくするにはどうしたらよいのでしょうか。

  4. 再泳動していただけるのはどのような場合ですか、その費用はどうなるのでしょうか。

  5. PCR産物を鋳型にした反応サンプルで、100b程度でピークが下がり、残りの配列を読めませんでした。もう少し長く読むには、どのような点に気をつければ良いでしょうか。DNA濃度は薄めに調整した方が良いのでしょうか。
2.解析データに関する質問への答え
  1. A1.「58」は受付No.で依頼メールにこちらが順番に振っているものです。 「21」はサンプルの通し番号です。それ以降の「G03」はサンプルウェルの番号、「013」はキャピラリーの番号です。 「_G03_013」は、解析後のファイル名に自動的に付与されます。

  2. 波形ファイルを開くためには専用のソフトが必要です。波形ファイルを開くソフトはこちらからダウンロードできますのでご利用ください。

  3. 未反応のDyeと見られるピークの原因は、ほとんどの方が4℃で遠心していらっしゃること、使用する塩の濃度が高いこと、エタノールの終濃度（75％が適正）が高いこと、などです。それ以外では、以下の作業で改善されているようです。

    1）BigDye酵素液に対して鋳型DNAが少なすぎた結果、余剰のDyeが出るケース。

    対策1. 反応あたりのテンプレートDNA量を増やす。
    対策2. BigDye 反応液 を５x Sequencing Buffer で希釈して使用する（1/4、1/8等）。

    ２）チューブの壁に余剰のDyeが残っているケース。

    対策1.リンスする時に、チップの先端をチューブの壁にあてて、壁全体を洗うように70％エタノールを注ぐ。
    対策2. リンス時の70％エタノールの量を増やす、リンスの回数を増やす。
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  1. 再泳動を行うのはポリマー充填の不具合が疑われる以下のような場合で、無料で行っています。

    1. １回目の泳動で波形が得られなかったとき。
    2. ピークの高さが途中から半減、低下するなどして泳動が乱れたばあい。
    3. ブロードなピークが出て、不確定塩基「N」が出たとき。
    4. スパイクノイズが入ったとき。

    ただし、サンプルに問題がある場合には再泳動を行っても、波形は出ません。

  2. DNAが過剰な場合、逆に少なすぎる場合に解読範囲が短くなることがあります。適正なDNA濃度で反応してください。また、RNAやエタノール、EDTAなどの夾雑物が混入していると、シーケンシング反応がうまくいかないことがありますのでご注意ください。

    反応に使用するテンプレートの量
    • Single-stranded DNA… 25-50ng
    • Double-stranded DNA… 150-300ng
    • PCR products
      • 100-200bp… 1-3ng
      • 200-500bp… 3-10ng
      • 500-1000bp… 5-20ng
      • 1000-2000bp… 10-40ng
      • >2000bp…… 20-50ng　（Big Dye ver.3.1のプロトコルより抜粋）

    波形データに関するトラブルシューテイングは以下のサイトが参考になります。
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広島大学・自然科学研究支援開発センター 遺伝子実験部門（遺伝子実験施設）