HOME >受託解析サービス > DNA塩基配列決定サービス > Q&A集
1.サンプルに関する質問
  1. サンプルはどちらに持参すればよろしいでしょうか。
  2. サンプルは1サンプルのみでも可能でしょうか。
  3. 申し込みでは13サンプルでしたが、11サンプルになってしまいました。サンプル数の変更は可能でしょうか。

  4. Dynamic ETで酵素反応したサンプルは受け入れは可能ですか。
  5. DNAサンプルはPCR産物のままではなく、なんらかの方法で精製したものでないといけないのでしょうか。
  6. 既に解析していただいたテンプレートについて別のプライマーで解析してもらうことは可能でしょうか。新たにテンプレートを用意する必要があるでしょうか。

  7. カスタマープライマーの精製度はゲルろ過精製でも大丈夫でしょうか。
  8. プライマーは，TE希釈したものでよろしいでしょうか。
  9. PCR産物のDNA配列決定を依頼したいのですが、シークエンスプライマーはPCR反応に用いたPCRプライマーそのものでも大丈夫でしょうか?Tm値や長さに制限等がありますか。

  10. テンプレートDNAの量は、どれくらい加えればよいのでしょうか。
  11. 依頼するDNAサンプルについてPCR産物でも可能とホームページにありますが，プラスミドに挿入する前のPCR産物でも可能でしょうか？

  12. シークエンス解析サービスの休止中にサンプルを調製してしまった場合、解析用のサンプルはサービス開始までどうやって保存したらいいんでしょうか。
1.サンプルに関する質問への答え
  1. サンプルは、業務時間内に、自然科学研究支援開発センター　(遺伝子実験施設)、3階の研究室3までお持ち下さい。

  2. 可能です。

  3. 可能です。サンプルをお持ちになる時に変更後のサンプル数をお知らせ下さい。

  4. 申し訳ありませんが、DYEnamic ETのサンプルは、現在おひきうけしていません。酵素反応にはApplied Biosystems社の BigDyeR Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitをご使用下さい。

  5. PCR産物の場合には、カラムで精製、あるいは、アガロース電気泳動等で目的のバンドを切り出し、精製、乾燥させ、50ng/μlの濃度に調製した溶液を5〜10μlお持ちいただいております。もし、上記の濃度にサンプルを調製するのが難しい場合には、およその濃度と量をお知らせ下さい。また、その場合、サイクルシーケンシング反応に使用するためのプライマーもお持ち下さい。こちらの濃度は5μMで、量は10〜20μlで十分です。

  6. テンプレートDNAが残っていれば、別プライマーでの解析は可能です。ただし、新たにお申し込みをお願いいたします。受付番号をお知らせ頂ければ、テンプレートの残りが反応に十分使用できるかどうか確認します。
｜▲top｜
  1. ゲルろ過精製でもおそらく大丈夫だと思います。当方で準備しているプライマーも、以前はゲルろ過精製でしたが、問題なく蛍光が検出されました。シーケンシング反応の成否は、実際に反応してみなければわかりませんので、ご心配でしたら、１サンプルお試しになられてはいかがでしょうか。

  2. プライマーは『水（滅菌水、ミリQ水等）』で希釈して下さい。TEに含まれるEDTAが、濃度によっては、酵素反応を阻害する可能性があります。

  3. 通常のプライマーはシーケンシングにも利用できます。ただし、以下の場合には、配列決定が困難な場合がありますので、ご確認下さい。
    1. 混合プライマーの場合
      これまでの経験では、相同遺伝子をクローニングする際に使用した混合プライマーでは、波形が得られませんでした。
    2. PCR断片が１００b未満など、極端に短い場合
      配列データが得られるのは、シーケンスプライマーからおよそ５０b下流以降の塩基からになります。PCR断片が極端に短い場合には、配列データが得られない場合がありました。
    3. TM値が５０℃未満の短いプライマー
      当方では、サイクルシーケンシング反応時に、アニーリング温度を５０℃に設定しています。ですので、極端に低いTM値のプライマーでは波形が得られない場合があります。
    4. 蛍光標識されたプライマーの場合
      蛍光標識されたプライマーで反応を行ったことがありますが、やはり、標識の蛍光がバックグラウンドノイズとして検出されました。ただし、波形が全く読めないほどではありませんでした。
｜▲top｜
  1. テンプレートの量は、Big Dyeのプロトコル（以下）に従っています。

    • Single-stranded DNA…25-50ng
    • Double-stranded DNA…150-300ng
    • PCR products
      • 100-200bp… 1-3ng
      • 200-500bp… 3-10ng
      • 500-1000bp… 5-20ng
      • 1000-2000bp… 10-40ng
      • >2000bp…… 20-50ng　（Big Dye ver.3.1のプロトコルより抜粋）

    ただし、サイズが2000bpを越えるテンプレートの場合には、

    テンプレートDNAの総塩基数　x　0.1　ng

    で算出される量を使用しています。

    実際には、精製される方によって濃度が違うようですので、最初に数サンプル程度お試しになられて、良好な波形が得られることをご確認ください。

  2. カラムやアガロースゲル等できちんと精製されたDNAで、50ng/μlの濃度の溶液を5〜10μl程度準備していただけるのであれば可能です。ただし、シングルバンドのPCR産物に限ります。

  3. 調製後のプラスミド、PCR産物，プライマーの保存方法ですが、サンプルをチューブごと-20℃で冷凍保存してください。ご依頼の時には、凍結状態のサンプルをそのままお持ち下さい。
｜▲top｜

｜history BACK｜
  HOME >受託解析サービス > DNA塩基配列決定サービス > Q&A集
 
広島大学・自然科学研究支援開発センター 遺伝子実験部門（遺伝子実験施設）